冻存细胞
冻存液
90％HS和10％DMSO
步骤：
1.1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2.用细胞刮刀收集细胞；
3.将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；
4.弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml.）
5.分装于冻存管内，每管1ml；
6.置－80℃过夜，第二天移入液氮。
Geltin（明胶）包被
准备500ml 0.1％geltin溶液
1.将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2.最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1.加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
2.置室温30分钟；
3.去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1.去除培养液；
2.无钙镁PBS（Gibco）洗涤；
3.加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。
4.加入ES培养基使胰酶失活；
5.将细胞转入15 ml离心管中离心3min；
6.去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7.将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；
8.将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到——ES细胞有聚集成团的倾向）
9.建议按1：4－1：10的比率传代 （ATCC）
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
责任编辑：刀刀
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