第四节 含量测定
容量法、比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱法等，本章重点讨论四氮唑比色法、异烟肼比色法、Kober反应比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等。
一、四氮唑比色法
（一）四氮唑的种类 两种：2，3，5-三苯基氯化四氮唑（缩写为TTC），其还原产物为不溶于考，试大收集整理水的深红色三苯甲簪，λmax在480~490nm，也称红四氮唑（缩写为RT）。蓝四氮唑（缩写BT），其还原产物为暗蓝色的双甲簪，λmax在525nm左右。TTC和BT的结构式如下：
（二）反应原理
皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲簪。
可能路线为α-醇酮基，失去2个电子氧化为20-酮基-21醛基，在碱催化下，分子内部重排；有部分形成20-羟基-21-醛基，C20-C21键断裂形成甾基甲酸衍生物和甲醛，以前者为主。四氮唑盐得到2个电子，开环形成甲簪显色。
（三）测定方法 USP（23）采用蓝四氮唑；中国药典（1995版）和BP（1993）采用红四氮唑。
中国药典收载地醋酸泼尼松龙软膏的含量测定方法如下：
1.对照品溶液制备：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.供试品溶液的制备：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，在置冰浴中放冷后，滤过，滤液滤入100ml量瓶中，同法提取3次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
3.测定法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40~45min，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。
（四）讨论 本法广泛用于皮质激素的测定，但测定时受结构、溶剂、显色温度和时间、水分、碱的浓度、空气中氧等，对反应速度、呈色强度和稳定性都有影响。
1.基团的影响：C11-酮基反应速度快于C11-羟基甾醇；C21-羟基酯化后较其母体羟基的反应速度慢；当酯化了的基团为三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯时，反应更慢。
2.溶剂和水分的影响：5%以下不影响，超过大时，呈色速度减慢，采用无醛溶剂。
3.碱的种类和加入顺序的影响：氢氧化四甲基铵较好，常用。但有研究表明，皮质激素和氢氧化四甲基铵长时间（24h）接触后，皮质激素有部分分解，因此，先加四氮唑盐溶液再加碱液好。
4.空气中氧及光线的影响：反应及其产物对光敏感，因此必须用避光容器并置于暗处显色，同时达到最大显色时间后，立即测定吸收度。蓝四氮唑对对空气中氧敏感，明显影响颜色强度和稳定性，因此BP规定在加入试剂后要往容器中充氮气。
5.温度与时间影响：显色速度随温度增高而加快。一般以室温或30℃恒温条件下显色，易得重线性较好的结果。BP（1993）多数在30℃反应1h，中国药典多数在25℃暗处反应40~45min.
二、异烟肼比色法
（一）原理 甾体激素C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合形成黄色异烟腙，在一定波长下具有最大吸收。
某些具有两个酮基的甾体激素可行成双腙，如黄体酮、可的松氢化可的松等。
（二）测定方法 醋酸地塞米松软膏含量测定方法如下：
1.对照品溶液制备：精密称取醋酸地塞米松对照品25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密 量取5ml，用无水乙醇稀释至50ml，摇匀，即得。
2.供试品溶液的制备：精密称取本品适量（约相当于醋酸泼尼松龙2.5mg），置烧杯中，加无水乙醇约25ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸地塞米松溶解，在置冰浴中放冷后，滤过，滤液滤入100ml量瓶中，同法提取3次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
3.测定法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10ml，分别置具塞容器中置考试，大收集整理水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液（取异烟肼0.5g，加盐酸0.63ml，加甲醇使溶解成500ml，即得）10ml，摇匀，置55℃暗处保温45min，取出放冷至室温，用氯仿稀释至25ml，摇匀，照分光光度法，在415nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。
（三）讨论
1.溶剂选择：无水乙醇和甲醇好，其他受溶解度影响不能采用甲醇稳定性较好，呈色强度较高。
2.酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：酸与异烟肼试剂的摩尔比为2：1时可获得最大吸收度。
3.水分、温度、光线和氧的影响：水增高吸收度降低，缩合水解；温度升高，反应加速。在实验条件下，光与氧不影响反应。
4.反应的专属性：Δ4-3-酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应；其他长时间放置或加热后方可反应完全，因此在反应条件下，本法对Δ4-3-酮基甾体具有一定的专属性。
三、KOBER反应比色法
指雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有最大吸收。
反应分两步：与硫酸-乙醇共热产生黄色，在465nm处有最大吸收；加水或稀硫酸稀释重新加热显桃红色，在515nm处有最大吸收。
可能原理：通过去羟基、重排及甲基由C13移到C17而形成产物（1）；然后被硫酸氧化形成具有较长共扼双键发色团的产物（3）及进一步生成具有吸收光谱红移发色团的产物（4）。
铁-酚试剂文献上也称铁-柯柏试剂。为硫酸亚铁铵加水溶解后，加硫酸及过氧化氢，再与苯酚混合制成。改进法，优点：铁加速速度和强度，加速黄色转变为红色，也增加稳定性；酚加入，可以消除反应中产生的荧光并加速红色的形成。
炔雌醇片的含量测定方法如下：
1.对照品溶液制备：精密称取炔雌醇对照品25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密 量取2ml，用无水乙醇稀释至50ml，摇匀，即得（10μg/ml）。
2.供试品溶液的制备：取本品10片或20片，置具塞试管中，加水10ml，振摇使崩散、置水浴上加热至半透明，放冷，精密加氯仿10ml，密塞，振摇20min，静置分层后，吸取上层水溶液，加无水硫酸钠0.5g，振摇脱水后，经干燥滤纸滤过，弃取初滤液，精密量取续滤液2ml，置水浴中蒸干后，低温干燥，放冷，精密加无水乙醇使溶解成每1ml中约含10μg的溶液，即得。
3.测定法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置试管中，在冰浴中冷却，各精密滴加硫酸-乙醇（4：1）4ml，摇匀显色后，在530nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。
四、紫外分光光度法
许多甾体激素分子中存在Δ4-3-酮基（C=C-C=O）和苯环（C=C-C=C）共扼系统，因而在紫外光区有特征吸收，240nm附近有最大吸收，有苯环的在280nm附近有最大吸收，可用于含量测定。
95版中国药典中25中甾体激素原料及片剂用该法测定含量，占本类药物分析的28%，仅次于HPLC.
紫外分光光度法准确、简便，被广泛用于原料和制剂的分析，但在片剂分析时需要预处理排除干扰。
醋酸可的松片的测定方法：
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（相当于醋酸可的松20mg），置100ml量瓶中，加无水乙醇75ml，时时振摇约1h，使醋酸可的松溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml，置另一100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，在238nm的波长处测定吸收度，按醋酸可的松的吸收系数（E1%1cm）为390计算，即得。
五、高效液相色谱法
特点：样品用量少、灵敏度高、分离效能好、快速等优点，各国药典多采用。中国药典89中甾体激素原料和制剂中，有43种采用HPLC法（内标法多），占该类药物分析方法的48%，居首位。反相分配色谱最广。固定相常用十八烷基硅烷键和硅胶；流动相甲醇-水-乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水等的混合液。为了提高分离效率、获得满意的峰形，有时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调节流动相的pH值，紫外直接检测。
醋酸泼尼松龙的测定方法如下：
1.色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充柱，甲醇-水（70：30）为流动相，检测波长为240nm.理论塔板数按醋酸泼尼松龙计算应不低于3000，醋酸泼尼松龙和内标物质峰的分离度应符合要求。
2.内标溶液的制备 取醋酸氟氢松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。
3.测定法 取醋酸泼尼松龙对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.50mg的溶液；精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品适量，同法测定，按内标法以峰面积计算，即得。
甾体激素类药物的分析
1、分类和结构特征与分析的关系：
（1）分类：肾上腺皮质激素，雄性激素及蛋白考，试大收集整理同化激素，性激素，孕激素，唯激素
（2）结构特征与分析的关系
（a）△4-3-酮基：可与羰基试剂发生缩合反应，可供鉴别及含量测定；
（b）17-α-醇酮基：具还原性，可与Feling‘s试剂反应生成红色氧化亚铜，也可与硫酸苯肼作用呈色，可供鉴别及含量测定；
2、特殊杂质检查方法：
本他甾体用TLC法检查。
3、含量测定方法：
HPLC法
四氮唑比色法。
责任编辑：张瑶
您现在的位置： 